Inducción de la formación de sinapsis mediante síntesis de novo de neurotransmisores.

Nature Communications volumen 13, número de artículo: 3060 (2022) Citar este artículo

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Una cuestión vital en neurociencia es cómo las neuronas alinean sus estructuras postsinápticas con los sitios de liberación presinápticos. Aunque se sabe que las proteínas de adhesión sináptica contribuyen en este proceso, el papel de los neurotransmisores aún no está claro. Aquí investigamos si la biosíntesis de novo y la liberación vesicular de un transmisor no canónico pueden facilitar el ensamblaje de sus correspondientes postsinapsis. Demostramos que, tanto en neuronas humanas derivadas de células madre como en neuronas de ratón in vivo de identidad puramente glutamatérgica, la expresión ectópica de enzimas de síntesis de GABA y transportadores vesiculares es suficiente para producir GABA a partir de glutamato ambiental y transmitirlo desde terminales presinápticas. Esto permite una acumulación eficiente y una activación constante de los receptores GABAA postsinápticos y genera sinapsis GABAérgicas completamente funcionales que operan en paralelo pero independientemente de sus contrapartes glutamatérgicas. Estos hallazgos sugieren que la liberación presináptica de un neurotransmisor puede indicar la organización del aparato postsináptico relevante, que podría modificarse directamente para reprogramar la identidad sináptica de las neuronas.

Las neuronas se comunican entre sí a través de estructuras especializadas llamadas sinapsis. Aún no está claro cómo las sinapsis establecen y mantienen su identidad. Según una teoría, las moléculas de adhesión celular sináptica (SAM) desencadenan la formación de sinapsis al promover interacciones transsinápticas entre los componentes pre y postsinápticos1,2,3. En apoyo de esta hipótesis, la expresión ectópica de SAM puede mejorar o inducir, respectivamente, la sinaptogénesis tanto en neuronas como en células no neuronales4,5,6,7. Además, también se informó que las eliminaciones genéticas individuales de algunas SAM disminuyen el número de sinapsis en grados variables, aunque no eliminaron por completo el ensamblaje de sinapsis8,9,10.

Curiosamente, a pesar de estos pocos casos, los modelos de eliminación constitutiva o condicional (KO) para la gran mayoría de SAM no muestran ningún deterioro a gran escala en la formación de sinapsis y sólo afectan su maduración funcional, lo que en ocasiones podría conducir a una pérdida posterior de sinapsis a lo largo del tiempo11,12,13,14,15. Además, los mecanismos dependientes de SAM aún deben explicar la producción de diferentes tipos de sinapsis, porque varias SAM postsinápticas localizadas específicamente en las sinapsis principales glutamatérgicas o del ácido γ-aminobutírico (GABA) -érgicas a menudo pueden interactuar con socios de unión presinápticos comunes que son igualmente distribuido en ambos tipos de sinapsis16,17,18. Por lo tanto, señales celulares alternativas distintas a las SAM podrían ser necesarias primaria o simultáneamente para la sinaptogénesis y la alineación confiable del aparato sináptico complementario.

Un segundo modelo de sinaptogénesis implica que la liberación de neurotransmisores puede modular directamente este proceso. En respuesta a diversos transmisores producidos en las terminales presinápticas, sus compartimentos postsinápticos reclutan distintas clases de receptores que confieren propiedades funcionales a las sinapsis. Esta teoría se ve reforzada por estudios que muestran que la eliminación de los receptores GABAA (GABAAR) puede alterar tanto la morfología como la especificidad del objetivo de un subconjunto de sinapsis GABAérgicas19,20. Se obtuvo evidencia adicional de disposiciones postsinápticas dependientes del transmisor a partir de observaciones recientes de que diferentes cotransmisores sintetizados dentro de una sola neurona a menudo pueden segregarse en terminales presinápticas independientes que entran en contacto con distintas poblaciones de células postsinápticas21,22,23. Además, algunas neuronas pueden incluso cambiar entre tipos de transmisores de manera dependiente de la actividad, lo que a su vez altera sus niveles y composiciones de receptores correspondientes en las postsinapsis24,25.

Quizás el caso más convincente de la sinaptogénesis inducida por transmisores surge de dos estudios fundamentales que demuestran que la fotólisis rápida del glutamato y GABA "enjaulados" cerca de las ramas dendríticas puede causar la acumulación local de receptores postsinápticos y proteínas de andamio, lo que resulta en la formación de sinapsis inmaduras que eventualmente pueden integrarse en circuitos neuronales existentes26,27. Este fenómeno también se reprodujo con éxito en diferentes subtipos neuronales ubicados en diversas regiones del cerebro de un amplio rango de edades de animales28,29,30. Sin embargo, aún se desconoce (i) si tales mecanismos pueden operar durante la liberación de neurotransmisores presinápticos fisiológicamente relevantes, (ii) si estas sinapsis nacientes inducidas por transmisores experimentan una mayor maduración morfológica y/o funcional, (iii) si la identidad transmisora ​​de una neurona misma podría manipularse deliberadamente utilizando factores exógenos, (iv) si cambiar el neurotransmisor liberado podría conducir directamente a la producción de diferentes tipos de sinapsis, y (v) si estas sinapsis inducidas por transmisores también podrían desarrollarse in vivo, especialmente en animales vivos. Abordar estas preguntas podría permitir comprender los principios fundamentales de cómo se forman las sinapsis y adquieren sus identidades.

En este estudio actual, nos propusimos determinar si la expresión ectópica de enzimas presinápticas exógenas y transportadores vesiculares puede impulsar tanto la biosíntesis como la liberación sináptica de un transmisor alternativo en neuronas comprometidas con el linaje, e iniciar la formación de postsinapsis funcionales de un linaje diferente. amable. Descubrimos que una sobreexpresión combinatoria de tres proteínas, es decir, vGAT, GAD65 y GAD67, puede sintetizar y transmitir GABA de manera adecuada incluso desde neuronas exclusivamente glutamatérgicas, lo que desencadena una producción eficiente de sinapsis de salida GABAérgicas morfológica y funcionalmente maduras, tanto in vitro como in vivo. .

En primer lugar, nuestro objetivo era comprender cómo las neuronas glutamatérgicas protegen su identidad transmisora ​​en las salidas sinápticas y previenen otras especificaciones, por ejemplo, los programas GABAérgicos. Para este fin, empleamos un sistema modelo previamente establecido que genera rápidamente neuronas glutamatérgicas puras a partir de células madre embrionarias humanas (ES, por ejemplo, línea H1) mediante la expresión forzada de un único factor de transcripción Neurogenina-2 (es decir, Ngn2; Fig. 1a). . Los registros de pinza de voltaje (potencial de mantenimiento, Vhold = −70 mV) en el día posterior a la inducción ≈ 56–60 detectaron corrientes postsinápticas espontáneas (sPSC) robustas con actividades de red recurrentes (Figura complementaria S2a). Estos eventos sinápticos estaban compuestos predominantemente de sPSC excitadoras (es decir, sEPSC), ya que podían suprimirse fácilmente mediante la aplicación aguda de un antagonista del receptor AMPA (AMPAR), cianquixalina (CNQX), pero no mediante la picrotoxina (PTX), antagonista de GABAAR, lo que implica que Ngn2- las neuronas carecen de GABAAR postsinápticos, de liberación de GABA presináptico o de ambos (Figura complementaria S1a). Sin embargo, las perfusiones de agonistas exógenos en las mismas condiciones experimentales revelaron la existencia de GABAAR completamente funcionales y sensibles a PTX además de los AMPAR, lo que indica que estas neuronas solo transmiten glutamato pero probablemente no GABA desde sus terminales presinápticas (Figura complementaria S1b). .

a Se indujo neurogénesis en células H1-ES mediante la expresión lentiviral de Ngn2, coinfectadas con virus adicionales que codifican vGAT, GAD65 y/o GAD67; Las neuronas se cultivaron conjuntamente con glía de ratón y se analizaron entre los días 56 y 60. b Una imagen de ejemplo de neuronas humanas inducidas por Ngn2 (puntas de flecha cian) cotransducidas con factores V57, inmunomarcadas para MAP2, sinapsina y teñidas para DAPI nuclear (puntas de flecha blancas). La población MAP2 negativa y teñida con DAPI indica células gliales de ratón cocultivadas. Recuadro de puntos insertado ampliado a la derecha. c, d Trazas de muestra de sPSC registradas a partir de las condiciones indicadas c, y frecuencia acumulada normalizada de desintegraciones τ d para eventos rápidos versus lentos (puntas de flecha azules versus rojas). Inserciones en d, formas de onda de ejemplo de 10 sPSC escaladas y superpuestas (sombra clara) con los promedios correspondientes (sombra oscura) para el control (arriba) frente a V57 (abajo). e, f Frecuencia promedio (izquierda) y amplitud (derecha) de eventos de sPSC con cinética de desintegración rápida (e, τ-decay < 10 ms) versus lenta (f, τ-decay > 10 ms), registrada en neuronas humanas que expresan combinaciones de factores indicadas. g, h Trazas representativas g e histograma acumulativo de desintegración τ h de sPSC registradas a partir de neuronas Ngn2 que coexpresan factores V57, antes (Ctrl) y después de tratamientos agudos con PTX y/o CNQX (como se indica). Yo-k. Probabilidades acumuladas (izquierda) y valores promedio (derecha) del ancho medio de sPSC (i), amplitud (j) y frecuencia de eventos (k), medidos en ausencia (Ctrl) o presencia de inhibidores, PTX, CNQX o ambos. PTX + CNQX. Todos los datos se presentan como medias ± SEM, con número de células parcheadas/lotes independientes. Los puntos de datos individuales se proporcionan como círculos abiertos del mismo color. Para los paneles e, f, la significación estadística se evaluó mediante la prueba de Kruskal-Wallis combinada con la prueba U de Mann-Whitney no paramétrica post-hoc utilizando la corrección de Bonferroni (ver Datos fuente). Para i, j, k, los valores de asimetría y curtosis (-2 >≈ y ≈ <2) sugirieron una distribución normal, ya que la significación estadística se sopesó mediante la prueba t de Student de dos colas, no apareada, con ***P < 0,005; **P < 0,01; *P < 0,05; ns = no significativo, P > 0,05. También se compararon múltiples grupos en el panel k mediante un análisis de varianza (ANOVA unidireccional) combinado con la prueba post-hoc de Tukey-Kramer, y se informaron los valores de P correspondientes.

Para identificar las maquinarias pre o postsinápticas que son esenciales para la neurotransmisión GABAérgica pero que posiblemente faltan en las células exclusivas de Ngn2, a continuación inspeccionamos los resultados de la secuenciación de ARN que habíamos obtenido previamente32. Notamos la presencia de varias subunidades GABAAR, así como de importantes moléculas inhibidoras de andamiaje postsináptico (p. ej., gefirina y colibistina), pero solo una expresión mínima de las glutamato descarboxilasas (es decir, GAD65 y GAD67) o del transportador vesicular GABA (vGAT) (Figura complementaria S1c). ). Sin embargo, estas células tuvieron una expresión sustancial de enzimas asociadas tanto con la biosíntesis de glutamato como con la carga vesicular (es decir, glutaminasa y vGLUT1/2), lo que confirma nuevamente su identidad glutamatérgica (Figura complementaria S1c). Por lo tanto, aunque la población de células postsinápticas puede contener componentes necesarios para el ensamblaje funcional de GABAAR, las neuronas Ngn2 carecen en gran medida de enzimas presinápticas para la síntesis de GABA y la transmisión vesicular.

A continuación, preguntamos si la expresión forzada de GAD65, GAD67 y/o vGAT en células glutamatérgicas Ngn2 puede sintetizar GABA a partir de glutamato ambiental y empaquetarlo en vesículas sinápticas para su posterior liberación. Clonamos ADNc humanos que codifican GAD65, GAD67 y vGAT bajo el promotor Synapsin-1 humano, elaboramos partículas de lentivirus a partir de las construcciones y coinfectamos neuronas Ngn2 con ellas (Fig. 1a). En los días 56 a 60 posteriores a la inducción, las inmunotinciones para MAP2 dendrítico y el marcador sináptico Synapsin revelaron una formación sustancial de sinapsis (Fig. 1b). Curiosamente, los registros electrofisiológicos de neuronas que coexpresan GAD65 + vGAT o GAD67 + vGAT, pero ninguno de los factores por separado, disminuyeron significativamente la frecuencia de las sPSC con desintegración τ rápida sin afectar su amplitud, y simultáneamente aumentaron tanto la frecuencia como la amplitud de las sPSC con desintegración τ más lenta que estuvo ausente en su mayoría en las neuronas exclusivas de Ngn2 (Fig. 1c-f). Por lo tanto, la coexpresión de las enzimas de síntesis de GABA junto con el transportador vesicular de GABA produjo eventos de sPSC probablemente con una identidad diferente a la de las EPSC típicas. Los mayores efectos observados fueron para la combinación vGAT + GAD65 + GAD67 (denominada en adelante V57, figura complementaria S2b).

Para determinar las identidades de los eventos de sPSC con desintegraciones τ rápidas versus lentas, a continuación aplicamos bloqueadores de receptores en células Ngn2 que coexpresan factores V57. Los tratamientos agudos de CNQX versus PTX previnieron selectiva y respectivamente las sPSC rápidas versus lentas con semianchos más pequeños versus más grandes, lo que sugiere que representan correspondientemente corrientes sinápticas excitadoras versus inhibidoras (es decir, EPSC versus IPSC; Fig. 1g-i ). Las IPSC espontáneas exhibieron amplitudes promedio considerablemente diferentes, pudieron inhibirse independientemente de las EPSC, y solo la aplicación de PTX + CNQX, pero ningún fármaco por sí solo pudo eliminar todos los eventos de sPSC (Fig. 1j, k). Estos resultados indican que los factores V57 pueden impulsar con éxito la formación de salidas GABAérgicas funcionales en neuronas humanas glutamatérgicas.

Dado que las sPSC podrían ser una mezcla de corrientes postsinápticas en miniatura (mPSC) independientes del potencial de acción (AP) y actividades de red dependientes de AP, buscamos caracterizar mejor sus contribuciones relativas en la liberación de GABA inducida por V57. En el modo de pinzamiento actual, las neuronas Ngn2 que coexpresan V57 (denominadas NV57) mostraron AP basales repetitivos, que fueron fácilmente abolidos por la tetrodotoxina (TTX), revelando despolarizaciones subumbrales indicativas de potenciales postsinápticos en miniatura auténticos independientes de AP (es decir, mPSP; Fig. .2a,b). En consecuencia, en las grabaciones con pinza de voltaje, la aplicación aguda de TTX redujo efectivamente la amplitud y frecuencia de las sPSC rápidas y lentas, pero no eliminó por completo todos los eventos (Fig. 2c-e). Un tratamiento sucesivo con CNQX abolió las mEPSC excitadoras rápidas mediadas por AMPAR e ilustró la coexistencia de mIPSC inhibidoras impulsadas por GABAAR insensibles a TTX con desintegraciones τ más lentas y anchos medios más anchos, que en consecuencia podrían silenciarse con el tratamiento con PTX (Fig. 2f) –h). Por lo tanto, las terminales presinápticas inducidas por V57 exhibieron liberación espontánea de GABA tanto de manera dependiente de AP como de manera independiente de AP, activando con éxito los GABAAR postsinápticos.

a Registros con pinza amperimétrica de AP espontáneos, en ausencia (Ctrl, izquierda) o presencia de TTX (derecha). Inserciones, áreas ampliadas de las regiones encuadradas con AP (asterisco negro) o despolarización subumbral (asterisco morado). b Frecuencia media de AP espontánea (izquierda) o despolarización total (derecha), sin (Ctrl) o con TTX. C. Rastros representativos de sPSC (áreas encuadradas ampliadas a continuación) registradas en modo de fijación de voltaje desde la condición Ctrl versus tratamientos agudos de TTX, puntas de flecha que apuntan a eventos con desintegración τ rápida (azul) versus lenta (roja). d, e Gráficos de probabilidad y promedios de amplitud del evento (izquierda) y frecuencia (derecha) para sEPSC d o sIPSC e. f Rastros representativos de mPSC registrados en presencia de TTX únicamente (Ctrl), o después de la aplicación conjunta de CNQX, PTX o ambos (CNQX + PTX). Las puntas de flecha indican eventos EPSC rápidos (azul) frente a eventos IPSC lentos (rojo). g, h Frecuencia normalizada de desintegración τ para eventos de PSC en miniatura g; Recuadro = 10 trazos de muestra superpuestos (tonos claros) y sus promedios correspondientes superpuestos (tonos oscuros). Gráficas de probabilidad acumulada de medias anchuras de eventos con gráficos resumidos h, para mEPSC resistentes a PTX (azul) frente a mIPSC resistentes a CNQX (rojo). i Formas de onda representativas superpuestas (izquierda, artefactos de estímulo reemplazados por flechas), amplitudes promedio (centro) y CV (derecha) de PSC evocadas por> = 3 pulsos presinápticos consecutivos, según lo registrado en las condiciones indicadas. j Trazas de ejemplo (izquierda) de EPSC e IPSC evocadas por tren de pulsos (flechas); Los recuadros son estimulaciones pareadas sucesivas de entradas presinápticas con ∆t = 50 ms, presentadas como pruebas superpuestas (6 pulsos pareados consecutivos, tonos claros) con trazas promedio (sombras oscuras). Todas las amplitudes de PSC se normalizaron al primer pulso correspondiente (derecha). Tanto las EPSC como las IPSC manifestaron una depresión sináptica significativa, pero de diferente magnitud, posiblemente debido a diferentes grados de desensibilización y/o saturación de los AMPAR postsinápticos frente a los GABAAR y, por lo tanto, no pudieron compararse directamente como un indicador de las probabilidades de liberación presináptica. Todos los datos numéricos son medias ± SEM, con el número total de neuronas registradas/lotes experimentales y los puntos de datos trazados como círculos abiertos. Las significancias estadísticas se evaluaron mediante la prueba t de Student de dos colas, no apareada (valores de asimetría y curtosis −2 > ≈ y ≈ < 2), o la prueba U de Mann-Whitney no paramétrica de dos colas, para ***P < 0,005; *P < 0,05; ns = no significativo, P > 0,05. Se compararon varios grupos mediante ANOVA unidireccional (i, con valor de P).

Para examinar si el GABA puede liberarse mediante actividades presinápticas a gran escala, estimulamos las neuronas con un electrodo de campo y medimos las PSC evocadas. Una vez más, la aplicación aguda de CNQX detectó la presencia de componentes IPSC evocados prominentes, con un coeficiente de variación (CV) equivalente al de los EPSC evocados, que podrían ser abolidos posteriormente mediante el tratamiento con PTX (Fig. 2i). Además, cuando se activaban mediante un tren de estimulaciones de alta frecuencia o pares de pulsos repetitivos, estas IPSC evocadas presentaban una plasticidad clásica a corto plazo con una fuerte depresión sináptica, como también se observó para las EPSC evocadas (Fig. 2j). Por lo tanto, las presinapsis GABAérgicas no canónicas inducidas por V57 obtuvieron propiedades de liberación que eran comparables a las presinapsis glutamatérgicas normalmente producidas por las neuronas Ngn2, presumiblemente debido a que comparten maquinarias de liberación comunes.

Preguntamos si los factores V57 permitían la formación de nuevas estructuras sinápticas en las células Ngn2 o remodelaban sinapsis glutamatérgicas potenciales en un destino GABAérgico. Para probar eso, inmunoteñimos las células con anticuerpos presinápticos específicos (Figura complementaria S3a, b). No detectamos ningún defecto en la densidad celular ni en el crecimiento general de neuritas (Figuras complementarias S4a-c). La transducción de V57 no alteró el recuento o la morfología de las sinapsis totales marcadas por el anticuerpo Synapsina y causó solo un incremento menor en el tamaño de la presinapsis excitadora positiva para vGLUT sin cambiar su densidad (Fig. 3a, b). Sin embargo, los factores vGAT y GAD65/67 sobreexpresados ​​se organizaron principalmente en un patrón agrupado, lo que mejoró sustancialmente el tamaño y el número de presinapsis GABAérgicas, como lo demuestra su elaborada distribución a lo largo de las dendritas, que estaba prácticamente ausente en las neuronas exclusivas de Ngn2 (Fig. 3c, d). .

a Imágenes de muestra (izquierda) de neuronas Ngn2 únicamente frente a NV57 inmunoteñidas con el marcador pansináptico Synapsin. Valores promedio (derecha) de la densidad de los puntos de Synapsin normalizados por el área dendrítica MAP2 y el tamaño de los puntos. b – d Inmunotinciones similares a las de a, excepto el marcador de presinapsis glutamatérgico vGLUT b y los marcadores de presinapsis GABAérgicos GAD65/GAD67 c o vGAT d. e Imágenes representativas de ramas dendríticas marcadas con EGFP de Ctrl (solo Ngn2, fila superior) frente a neuronas V57 (fila inferior) coetiquetadas para vGLUT y vGAT (puntas de flecha amarilla y cian, respectivamente); Las proyecciones z de máxima intensidad resaltan una distribución intrincada de ambos tipos de sinapsis, especialmente en la condición V57. f La imagen de súper resolución (izquierda) de una única sección óptica de la condición V57 muestra una colocalización mínima entre las señales vGLUT y vGAT; las puntas de flecha grises apuntan a señales parcialmente superpuestas (cruz cian) resueltas en el eje x/z o y/z; El perfil de intensidad muestra la separación máxima entre señales de una región de interés (línea de puntos amarilla). Se representaron los coeficientes de Mander (derecha) de colocalización entre vGLUT y vGAT. g, h Igual que a, pero para marcadores postsinápticos glutamatérgicos (Homer, g) o GABAérgicos (Gephyrin, h). i Igual que e, excepto por la coexistencia de puntos elaborados de Homero y Gephyrin, especialmente en la condición V57. j Igual que f, pero para los puntos postsinápticos de Homero y Gephyrin que ilustran de manera similar una colocalización mínima. Los valores promedio en los gráficos de barras representan medias ± SEM para el número de campos de visión analizados/lotes independientes. Los puntos de datos individuales se proporcionan como círculos abiertos codificados por colores. La significancia estadística se sopesó mediante la prueba t de Student de dos colas, no apareada (para valores de asimetría y curtosis -2 >≈ y ≈ < 2), o la prueba U de Mann-Whitney no paramétrica de dos colas (datos de origen), con * **P < 0,005; **P < 0,01; *P < 0,05; ns = no significativo, P > 0,05.

Especialmente en las células V57, el co-etiquetado con anticuerpos vGLUT y vGAT demostró una intrincada coexistencia de ambos puntos, que ocasionalmente parecían superponerse en imágenes gruesas proyectadas en z (Fig. 3e). Para explorar si se pueden formar sinapsis de diferentes identidades dentro de las mismas regiones presinápticas, utilizamos microscopía de superresolución. Descubrimos que la mayoría de los puntos copositivos incluían señales vGLUT frente a vGAT que se originaban principalmente en diferentes planos focales y que podían resolverse aún más en dimensiones x/z o y/z (Figura complementaria S5a). Un análisis más detallado de secciones ópticas individuales más delgadas sugirió que la mayoría de los puntos sinápticos en la condición V57 comprendían señales vGLUT o vGAT, y no ambas (Fig. 3f). Por lo tanto, las presinapsis glutamatérgicas frente a las GABAérgicas produjeron en su mayoría sitios de liberación espacialmente segregados.

Para evaluar más a fondo cualquier efecto sobre la organización postsináptica, monitoreamos las distribuciones de los marcadores postsinápticos glutamatérgicos y GABAérgicos, por ejemplo, Homer y Gephyrin (Figuras complementarias S3a, b). Notamos que la cotransducción de V57 disminuyó versus aumentó, respectivamente, el número de puntos positivos de Homer versus Gephyrin sin afectar sus tamaños, tanto en los segmentos dendríticos como en las regiones perisomáticas de las células Ngn2 (Fig. 3g, h y Figura complementaria S6a). Las neuronas NV57 también mostraron aposiciones sustanciales entre la gefirina postsináptica y los grupos GABAAR de la superficie celular con vGAT presináptico y puntos GAD65/67 (Figuras complementarias S6b-d). A pesar de estos reordenamientos en las especificaciones sinápticas con una elevación significativa de las características GABAérgicas (Fig. 3i), la condición V57 continuó mostrando una co-localización limitada entre los grupos de Homero y Gefirina, que presentaban formas distintas y ocupaban diferentes posiciones físicas (Fig. 3j, y Suplementario). Figura S5b). Estos resultados implicaron que la liberación de GABA inducida por V57 desde las terminales presinápticas probablemente puede mejorar la acumulación postsináptica de gefirina y GABAAR, que ya se expresaban en neuronas exclusivas de Ngn2. Sin embargo, estas sinapsis GABAérgicas se ensamblan por separado, es decir, físicamente aisladas, de sus contrapartes glutamatérgicas.

Para evaluar qué tan temprano estas sinapsis inducidas adquieren identidad morfológica y desarrollan propiedades funcionales, analizamos las neuronas NV57 en diferentes momentos de desarrollo (Fig. 4a). Durante los días 15 a 60 posteriores a la inducción, las células maduraron gradualmente con un aumento constante en la capacitancia de la membrana (Cm), una reducción en la resistencia de entrada (Rm) y un aumento en la formación general de sinapsis, como se visualiza mediante el inmunomarcaje con sinapsina (Fig. 4b, c). . A continuación, para controlar la cinética de maduración relativa de las sinapsis glutamatérgicas frente a las GABAérgicas, realizamos grabaciones con parche. Notamos que las frecuencias y amplitudes tanto de las sEPSC mediadas por AMPAR como de las sIPSC mediadas por GABAAR aumentaron periódicamente durante este período de tiempo (Fig. 4d, e). También se observaron cinéticas de maduración similares tanto para EPSC como para IPSC evocadas, en términos de su fuerza y ​​​​tasas de éxito (Fig. 4f, g). De acuerdo, la inmunotinción con anticuerpos vGLUT y vGAT también reveló que las sinapsis glutamatérgicas y GABAérgicas comienzan a formarse ya en el día 15 y continúan aumentando en el día 30, ya que su densidad y tamaño tienden a saturarse alrededor del día 45-60 (Fig. 4h). i). Además, en el día 60, tanto los grupos vGLUT versus vGAT como los de Homer versus Gephyrin ocuparon individualmente solo una fracción de las señales totales de sinapsina, lo que respalda nuevamente la noción de que las sinapsis de diferentes identidades están en su mayoría segregadas (Fig. 4j, k). En conjunto, estos hallazgos sugieren que las sinapsis GABAérgicas inducidas por V57 maduran al mismo tiempo que las sinapsis glutamatérgicas, pero se estabilizan de forma independiente unas de otras.

un protocolo experimental para b – k; Las neuronas humanas inducidas por Ngn2 se infectaron adicionalmente con virus que expresaban factores V57 y se analizaron cada 15 días desde el día 15 posterior a la inducción hasta el día 60. b Gráficos resumidos de los valores de Cm (izquierda) y Rm (derecha), en diferentes momentos de maduración neuronal. c Imágenes de ejemplo (izquierda) y densidad o tamaño promedio (derecha) de Synapsin puncta constituidos en neuritas positivas para Tuj1, medidas a partir de neuronas NV57 en diferentes etapas de su desarrollo in vitro (ver anotado). d, e Trazas de muestra (izquierda) y parámetros promedio (derecha, frecuencia o amplitud del evento) de sEPSC d y GABAAR sIPSC e mediados por AMPAR registrados en presencia de PTX y CNQX, respectivamente, en los días 15 a 60. f, g EPSC provocadas por estimulación (f, con PTX) e IPSC (g, con CNQX) registradas en los puntos de tiempo indicados; rastros de ejemplo (izquierda), amplitudes promedio (centro) y porcentaje de células con respuestas detectables (derecha). h, i Igual que c, excepto por los puntos vGLUT (h) o vGAT (i) formados en ramas dendríticas positivas para MAP2. j. Imágenes representativas (izquierda) y coeficientes de Mander (derecha) de colocalización entre Synapsin puncta y señales vGLUT o vGAT. Las neuritas se visualizaron mediante coexpresión de EGFP soluble. Tanto las señales vGLUT como vGAT ocupan individualmente solo una fracción de las sinapsis totales positivas para sinapsina en el día 60. k Igual que j, excepto por la co-localización entre Synapsin y Homer o Gephyrin, en el día 60. Todos los datos representan medias ± SEM. Los gráficos de resumen también indican el número total de campos de visión analizados (para inmunotinción) o neuronas parcheadas (para electrofisiología)/lotes independientes, y puntos de datos individuales (círculos abiertos). La significación estadística para los datos distribuidos normalmente (valores de asimetría y curtosis entre −2 y 2) en los paneles j y k se calculó mediante la prueba t de Student de dos colas, no apareada, con ***P < 0,005; **P<0,01. Para todas las comparaciones grupales (curso de tiempo, b – i), se realizó ANOVA unidireccional y se indicaron los valores de P.

Dado que la producción de sinapsis GABAérgicas progresó en paralelo con su maduración funcional, preguntamos si la activación dependiente de GABA de GABAAR o GABABR podría promover la formación y/o la estabilidad a largo plazo de estas sinapsis inducidas. Para probar esto, llevamos a cabo tratamientos crónicos con el antagonista de GABAAR PTX o con el antagonista de GABABR CGP55845, intercambiamos la mitad de los medios con medicamentos en días alternos a partir del día 4 al 5 y analizamos las células en los días 56 a 60 (Fig. 5a). . Descubrimos que la aplicación de PTX, pero no de CGP, redujo considerablemente el número de vGAT y Gephyrin puncta sin afectar sus tamaños (Fig. 5b, c). El tratamiento crónico con PTX no afectó la supervivencia neuronal ni su arborización dendrítica, pero disminuyó la aposición entre las señales de vGAT y Gephyrin (Figuras complementarias S7a-c), lo que indica defectos específicos en la morfología de la sinapsis GABAérgica.

una estrategia experimental para los paneles b–f; Las neuronas NV57 se incubaron con inhibidores sinápticos, se intercambiaron la mitad de los medios cada dos días desde el día 4-5 posterior a la inducción hasta el día 56-60, y se analizaron posteriormente como se indica (flecha). b, c Imágenes de muestra (izquierda) y densidad o tamaño normalizado (derecha) de los grupos vGAT by Gephyrin c formados en dendritas positivas para MAP2, cuando se tratan con DMSO solo (control), PTX 100 µM o CGP55845 10 µM. d Formas de onda mIPSC representativas (arriba) y frecuencia o amplitud de eventos (abajo) representadas como distribución acumulativa (izquierda) con gráficos resumidos (derecha), para neuronas de control versus neuronas tratadas con PTX (a largo plazo). Los cultivos se lavaron minuciosamente con solución de baño antes de los registros electrofisiológicos; CNQX se utilizó para detener las EPSC. e Trazas de ejemplo (arriba) de corrientes GABAAR producidas por una bocanada de GABA de 1 mM y transferencia de carga total (abajo). f Imágenes de muestra (izquierda) de neuronas de control versus neuronas tratadas con PTX (puntas de flecha), inmunoteñidas para epítopos extracelulares de GABAAR de superficie y MAP2 dendrítico. Las regiones encuadradas se magnifican (recuadros recortados, arriba a la derecha), la densidad normalizada y los tamaños de los grupos GABAAR se trazan (abajo a la derecha), para control versus tratamiento con PTX. Todos los datos resumidos son medias ± SEM, con el número total de células registradas (electrofisiología) o campos de visión analizados (imágenes)/lotes independientes, y los puntos de datos individuales se incluyeron como círculos abiertos. Se predijo una distribución casi normal para la mayoría de los conjuntos de datos, según los valores de asimetría o curtosis (-2 >≈ y ≈ <2). Por lo tanto, la significación estadística se evaluó principalmente mediante la prueba t de Student de dos colas y no pareada, con ***P < 0,005; *P < 0,05; ns = no significativo, P > 0,05. Se compararon múltiples grupos (byc) mediante la prueba de Kruskal-Wallis combinada con la prueba U de Mann-Whitney no paramétrica post-hoc, y se informaron los valores de P correspondientes.

Para evaluar más a fondo cualquier efecto sobre las propiedades funcionales de las sinapsis GABAérgicas, examinamos la superficie y la localización sináptica de los GABAAR. Eliminamos PTX y ejecutamos grabaciones con pinza de voltaje en medios libres de drogas. De acuerdo con la reducción en el número de sinapsis GABAérgicas, las neuronas tratadas con PTX ilustraron un déficit significativo en la frecuencia de mIPSC sin cambiar su amplitud, cinética de eventos o propiedades intrínsecas de la membrana celular (Fig. 5d y Fig. Suplementaria S7d, e). Para evaluar si este fenotipo se debió al tráfico de GABAAR en la superficie inferior, aplicamos GABA exógeno mediante presión-perfusión, pero no notamos ningún efecto sustancial en la transferencia de carga de GABAAR, lo que implica un nivel similar de receptores en la superficie celular (Fig. .5e). Sin embargo, el tratamiento con PTX a largo plazo disminuyó la densidad de los grupos dendríticos de GABAAR sin afectar sus tamaños (Fig. 5f). Por lo tanto, la activación persistente de GABAAR pero no de GABABR regula las propiedades de desarrollo y/o el mantenimiento de las sinapsis GABAérgicas inducidas por V57.

A continuación, preguntamos si los fenotipos GABAérgicos mediados por V57 podrían reproducirse cuando las neuronas humanas se diferencian de células madre distintas de las células H1-ES. Para probar esta idea, aprovechamos una línea celular madre pluripotente inducida isogénica (iPS) que expresaba de manera estable el transgén Ngn2 tras la inducción con doxiciclina y generaba neuronas humanas con alta eficacia, que eran esencialmente glutamatérgicas y también carecían de expresión endógena de vGAT y GAD65/67. . Inmediatamente después de la inducción neural, los infectamos con virus V57, los cultivamos conjuntamente con glía y los caracterizamos en los días 35 a 42 cuando alcanzaron una morfología extensa (Fig. 6a y Fig. Suplementaria S8a). La población mostró cantidades considerables de transducción de ARNm de vGAT, GAD65 y GAD67, y localización de proteínas a lo largo de sus elaborados cenadores dendríticos (Fig. 6b, cy Fig. Suplementaria S8b-d). Estas estructuras sinápticas enriquecidas con vGAT también reclutaron SAM postsinápticos GABAérgicos importantes, por ejemplo, Neuroligina-2 (Figura complementaria S8e) 12,34,35.

a Imágenes de contraste de fase de células iPS (línea WTC-11, izquierda) y neuronas humanas diferenciadas (día 42, derecha). b, c RT-PCR cuantitativa (qRT-PCR, b) e inmunotinciones c contra transgenes vGAT o GAD65/67 en neuronas derivadas de células iPS, coetiquetadas para MAP2 dendrítico, DAPI nuclear y un antígeno nuclear humano HuNu. d Imagen de muestra de superresolución de un único plano confocal (izquierda) y los valores del coeficiente de Mander (% de área, derecha) confirman una colocalización mínima entre vGLUT frente a vGAT puncta (flechas amarillas frente a cian, respectivamente). e Trazas de ejemplo (izquierda) y relaciones corriente-voltaje (curvas IV; amplitudes máximas en Vhold = -80 a +20 mV, con incrementos graduales de 10 mV, derecha) de IPSC activadas por inhalaciones de GABA de 1 mM (flechas) en células iPS. neuronas derivadas, en condiciones de control y V57. Los datos promedio se ajustan mediante líneas rectas (ecuación: y = a + bx); a = 32,5 ± 10 pA, b = 22,33 ± 1,22 pA para neuronas de control, y a = 29,64 ± 18 pA, b = 27,89 ± 2,7 pA para la condición V57. f, g Trazas representativas f y frecuencias de eventos g de sPSC registradas en Vhold = −70 mV o +10 mV, en presencia de PTX o CNQX + CPP, en condición de control (arriba) frente a V57 (abajo), como se indica. Las marcas de división entre trazas concatenan grabaciones continuas de las mismas neuronas; sEPSC (flechas azules) o sIPSC (flechas rojas). h Trazas de ejemplo (izquierda) y amplitudes promedio de mIPSC insensibles a TTX (derecha) registradas en Vhold = −70 mV o +10 mV, en presencia de CNQX + CPP, de neuronas derivadas de células iPS transducidas con factores V57. i. IPSC evocadas generadas por estimulación repetitiva de alta frecuencia en condición V57; trazos superpuestos (izquierda) con liberación sincrónica confiable y componente de liberación retardada prominente (recuadro, puntas de flecha con cuadro de puntos ampliado) después de que se terminó el tren de estimulación (serie de flechas); amplitudes promedio de IPSC y depresión a corto plazo en diferentes Vhold, como se indica (derecha). Los valores promedio se proporcionan como medias ± SEM, con el número total de células registradas (para electrofisiología) o campos de visión analizados (imágenes)/lotes independientes, o solo el número de lotes (b). Todos los puntos de datos acoplados experimentalmente se proporcionan como círculos abiertos del mismo color con líneas conectadas. Las distribuciones de datos fueron aproximadamente normales (Datos de origen), para los valores de asimetría y curtosis -2 >≈ y ≈ < 2. La significación estadística se evaluó mediante la prueba t de Student de dos colas, pareada, con ***P < 0,005; *P < 0,05; ND = eventos no detectados.

De manera similar a las neuronas derivadas de células H1-ES, las inmunotinciones conjuntas para vGLUT frente a vGAT o Homer frente a gefirina en estas neuronas derivadas de células iPS también revelaron muy pocas co-localizaciones entre dos tipos de sinapsis diferentes, lo que sugiere nuevamente que la glutamatérgica frente a la GABAérgica las especificaciones ocupan zonas pre y postsinápticas mutuamente excluyentes (Fig. 6d y Fig. complementaria S8f, g). Las bocanadas de GABA exógeno demostraron IPSC hacia adentro considerables en Vhold ≈ −70 mV que se revirtieron alrededor de ≈ 0 mV, lo que confirma nuevamente la presencia de GABAAR de superficie también en neuronas derivadas de células iPS sin o con coexpresión de V57 (Fig. 6e). En registros continuos de las mismas neuronas en la condición de control, los tratamientos con CNQX junto con el bloqueador del receptor NMDA (NMDAR) ácido 3-carboxipiperazin-propilfosfónico (CPP) silenciaron la mayoría de las corrientes sinápticas independientemente del Vhold, corroborando su identidad glutamatérgica pura (Fig. .6f, g). En las células V57, la aplicación sucesiva de PTX y CNQX + CPP inhibió respectivamente las sIPSC y las sEPSC, lo que demuestra la coexistencia de sinapsis glutamatérgicas y GABAérgicas (Fig. 6f, g). Además, mantener las neuronas V57 a −70 mV, pero no a +10 mV (es decir, potencial de inversión de Cl cercano al estimado, ECl ≈ +14 mV, en configuración de célula completa sin tener en cuenta el potencial de unión), representó mIPSC auténticos incluso en presencia de TTX, así como también desencadenaron IPSC evocadas confiables con liberación retardada robusta y plasticidad pronunciada a corto plazo (Fig. 6h, i). Por lo tanto, nuestro enfoque fue altamente reproducible en la generación de sinapsis GABAérgicas humanas completamente operativas in vitro, independientemente de las líneas de células madre reprogramadas.

A continuación, nuestro objetivo fue investigar si los factores V57 pueden producir sinapsis GABAérgicas funcionales también en animales vivos. Para este experimento de prueba de principio, pretendemos utilizar un modelo de sinapsis glutamatérgica basada en dos criterios de selección: (i) el sitio de inyección viral (es decir, los cuerpos celulares de las neuronas presinápticas) está físicamente distante del sitio de grabación (es decir, cuerpos celulares de las neuronas postsinápticas), y (ii) la neurona postsináptica recibe entradas GABAérgicas insignificantes de otras fuentes. Estas limitaciones fueron necesarias para garantizar que la transducción viral de los factores V57 se dirija principalmente a la neurona presináptica glutamatérgica deseada, sin potenciar indirectamente ninguna entrada GABAérgica local a la célula postsináptica.

Con este fin, inyectamos partículas de virus en el ganglio espiral del ratón, lo que da lugar a fibras del nervio auditivo (AN) que proyectan salidas puramente glutamatérgicas (también conocidas como "bulbo terminal de Held") principalmente en los cuerpos celulares de las células tupidas (BC). ), situado a distancia en el núcleo coclear (Fig. 7a)36,37. Realizamos inyecciones lentivirales de factores V57 en los días 2 a 4 posnatales (P2 a 4), preparamos cortes de cerebro y los analizamos en P18 a 32, es decir, cuando un virus de control que codifica RFP mostró una transducción sustancial en el sitio de la inyección (Figura complementaria S9a). , b). Los BC carecen de cualquier entrada GABAérgica bien definida y reciben principalmente bulbos terminales glutamatérgicos positivos para Calretinina de alrededor de 4 a 5 fibras AN o terminales glicinérgicos positivos para vGAT de interneuronas locales, que forman sinapsis físicamente separadas entre sí (Fig. 7b) 38 ,39,40,41. Sin embargo, los animales transducidos con factores V57 demostraron un aumento prominente en la colocalización entre las señales de Calretinina y vGAT, lo que indica una inducción exitosa de transgenes dentro de los terminales de las fibras AN (Fig. 7b, c). Es de destacar que la eficiencia de transducción in vivo de lentivirus fue relativamente escasa en comparación con nuestro enfoque in vitro (ver Fig. 3c, d) y no alteró significativamente el tamaño del bulbo terminal (Fig. 7b, c).

Un diagrama esquemático muestra una estrategia experimental para manipular la identidad del transmisor de la sinapsis del bulbo terminal. b Imágenes representativas de somas BC (círculos cian) rodeados por terminales presinápticos positivos para calretinina y vGAT, en animales de control (izquierda) frente a animales inyectados con V57 (derecha). Las señales de vGAT a menudo se superponían con los terminales del bulbo terminal positivos para Calretinina en la condición V57 (flechas amarillas), pero mínimamente para la condición de control (flechas blancas). c Tamaño promedio de los terminales AN medidos utilizando señales de calretinina (izquierda), área del bulbo terminal ocupada conjuntamente por la señal vGAT (centro) y fracción de bulbos terminales que coexpresan vGAT (derecha), presumiblemente inducida por los factores V57. d, e Trazas de muestra d y distribución de frecuencia de τ-decaimientos e de sEPSC (puntas de flecha azules e histograma) y sIPSC (puntas de flecha rojas e histograma) registrados desde las condiciones de control (izquierda) frente a V57 (derecha). Inserciones en e, muestras de trazas de sEPSC y sIPSC escaladas y superpuestas para comparar la cinética de sus eventos. Todos los registros se realizaron en presencia de estricnina 1 µM para suprimir las sIPSC de las entradas glicinérgicas locales. f, g Gráficos de probabilidad acumulada y gráficos de barras promedio de frecuencia de eventos (izquierda) y amplitudes (derecha), para sEPSC mediadas por AMPAR f o sIPSC g mediadas por GABAAR. h Trazas de ejemplo de PSC evocadas (artefactos de estímulo reemplazados por flechas grises), registradas desde la condición de control (izquierda) frente a V57 (derecha), después del tratamiento agudo con estricnina 1 µM (trazas azules), o después de las adiciones de NBQX + 10 µM CPP 5 µM (trazas rojas) y bicuculina 20 µM (trazas negras). Puntas de flecha, EPSC (azul) o IPSC (rojo). i Los gráficos circulares representan una fracción de células con los tipos de PSC indicados (ya sea solo EPSC, solo IPSC o ambos). j Amplitudes de EPSC evocadas (izquierda) e IPSC (derecha), promediadas a partir de neuronas con respuestas exitosas. Los promedios indican la media ± SEM, con el número total de campos de visión analizados (para imágenes) o neuronas parcheadas (para grabación con parche) / número de animales inyectados y puntos de datos individuales (círculos abiertos codificados por colores). La significación estadística se probó mediante la prueba t de Student de dos colas, no pareada (resultados casi distribuidos normalmente), o la prueba U de Mann-Whitney no paramétrica de dos colas, con ***P < 0,005; **P < 0,01; *P < 0,05; ns = no significativo, P > 0,05.

Para determinar si las expresiones ectópicas de V57 en bulbos terminales glutamatérgicos pueden desencadenar la formación de sinapsis GABAérgicas funcionales, realizamos registros de pinzamiento de voltaje de BC postsinápticos en presencia de estricnina que inhibe preferentemente los receptores de glicina (GlyR) sobre los GABAAR. En condiciones de control, los BC exhibieron en su mayoría sEPSC con desintegraciones τ rápidas, mientras que la inducción de V57 causó un aumento profundo en sIPSC con desintegraciones τ más lentas (Fig. 7d, e). La transducción en mosaico de factores V57 mediada por lentivirus no cambió ni la amplitud ni la frecuencia de las sIPSC, pero elevó sustancialmente la frecuencia de las sIPSC sin afectar la amplitud de las sIPSC (Fig. 7f, g).

Finalmente, inspeccionamos las PSC de BC provocadas por la estimulación presináptica de AN. En los animales de control, las PSC evocadas insensibles a la estricnina mostraron una cinética de descomposición rápida y fueron bloqueadas en gran medida por el tratamiento agudo con el antagonista de AMPAR NBQX (Fig. 7h, i). Sin embargo, los animales transducidos por factores V57 a menudo mostraban la copresencia de un componente IPSC más lento que solo podía ser inhibido por el bloqueador GABAAR Bicuculina (Fig. 7h, i). Varios BC en la condición V57 también manifestaron IPSC predominantemente evocadas sin EPSC detectables, un fenómeno que nunca se observó en la condición de control (Fig. 7i). Cuando se promedió a partir de BC solo con una respuesta mensurable, la inducción de V57 elevó significativamente la amplitud de las IPSC evocadas sin alterar las EPSC (Fig. 7j). Por tanto, los factores V57 pueden desencadenar con éxito la formación de sinapsis GABAérgicas funcionales también en un sistema in vivo.

El sistema nervioso central de los mamíferos contiene diferentes tipos de sinapsis que liberan y detectan una variedad de neurotransmisores. La capacidad de sintetizar y transmitir estas distintas sustancias químicas a menudo requiere conjuntos de enzimas mutuamente excluyentes, así como transportadores vesiculares que se expresan endógenamente en ciertos linajes neuronales. Una vez establecidos los destinos neuronales durante el desarrollo temprano, el tipo de transmisor producido por una neurona presináptica se considera estable e irreversible. Dado que la identidad del transmisor es una característica inherente de subtipos neuronales específicos, todas las conexiones sinápticas formadas entre un par determinado de neuronas son generalmente homotípicas, por ejemplo, glutamatérgicas o GABAérgicas, lo que no suele cambiar con el tiempo42,43.

Aquí ilustramos que la expresión ectópica de vGAT + GAD65 + GAD67 puede asignar una identidad GABAérgica robusta en neuronas humanas y de ratón exclusivamente glutamatérgicas. Esta liberación presináptica de GABA fue capaz de activar los GABAAR postsinápticos y produjo sinapsis GABAérgicas completamente funcionales que manifestaron IPSC auténticas en miniatura y dependientes de AP con pronunciada plasticidad a corto plazo (Figs. 1 y 2). Estos fenotipos GABAérgicos fueron altamente reproducibles en múltiples líneas celulares, tanto para sistemas in vitro como in vivo (Figs. 6 y 7). La reprogramación directa del tipo de transmisor no alteró el número total de sinapsis, pero provocó una reorganización en las estructuras pre/postsinápticas (Fig. 3). Las sinapsis GABAérgicas inducidas se formaron independientemente de las sinapsis glutamatérgicas vecinas, pero exhibieron una cinética de maduración similar y dependieron parcialmente de la actividad de GABAAR (Figs. 4 y 5). En resumen, nuestro enfoque instituyó una vía fácil para inducir sinapsis funcionales mediante la síntesis de transmisores de novo (Figura complementaria S10a).

Nuestros hallazgos son totalmente consistentes con un informe anterior que indica que la capacidad de liberar glutamato frente a GABA por diferentes subtipos neuronales podría depender principalmente de su expresión diferencial de enzimas específicas del transmisor y transportadores vesiculares44. Una vez producidas, las vesículas que contienen diferentes transmisores no necesariamente requieren maquinaria de liberación especializada y exclusiva para los diferentes tipos de sinapsis. En consonancia con esta teoría, estudios anteriores también han descrito la cotransmisión de diferentes sustancias químicas desde las mismas neuronas y, a veces, incluso desde las mismas terminales presinápticas con sitios de liberación espacialmente segregados pero morfológicamente similares21,23,45,46,47,48,49 .

Curiosamente, aunque las neuronas que expresan V57 sintetizaron tanto glutamato como GABA, produjeron eventos mEPSC y mIPSC mutuamente excluyentes con cinéticas distintas. Estos, a su vez, podrían inhibirse individualmente mediante bloqueadores selectivos de receptores sin atenuar la frecuencia de otros tipos de eventos (Figs. 1, 2, 6 y 7). Estos resultados implican que el glutamato y el GABA se cotransmiten, pero probablemente no se liberan simultáneamente para coactivar sus receptores correspondientes. Además, los marcadores pre y postsinápticos que etiquetan las sinapsis glutamatérgicas frente a las GABAérgicas también manifestaron una colocalización limitada (Figs. 3 y 6, y Figs. Suplementarias S5, S8f, g), lo que indica que están físicamente segregados (Fig. Suplementaria S10b). . Nuevamente, se observó un fenómeno similar in vivo para diferentes cotransmisores, que a menudo se distribuyen en vesículas sinápticas separadas y se liberan de forma independiente45,47,50.

¿Cómo facilita la liberación presináptica de GABA la creación de sinapsis funcionales? Hallazgos recientes sugieren que la activación de GABAAR puede desempeñar un papel crítico en esta vía, ya que se ha demostrado que la eliminación genética de las subunidades de GABAAR o la inhibición farmacológica con antagonistas específicos altera la formación de sinapsis GABAérgicas20,27. Aunque está de acuerdo con esta noción, la exposición prolongada a PTX también redujo la densidad de las sinapsis GABAérgicas inducidas por V57, pero no logró eliminarlas por completo (Fig. 5). Además, aunque los factores V57 elevaron la densidad de las postsinapsis GABAérgicas, ya estaban presentes niveles sustanciales de grupos de Gefirina y GABAAR incluso en neuronas exclusivas de Ngn2, que carecen de liberación presináptica de GABA. Por tanto, mecanismos celulares adicionales también podrían contribuir al desarrollo de sinapsis GABAérgicas. Por ejemplo, los GABAAR interactúan directamente con las neurexinas presinápticas y también pueden ensamblarse potencialmente en complejos moleculares con neuroliginas postsinápticas, gefirina y/o colibistina para establecer una alineación pre y postsináptica con o sin liberación de GABA34,51,52. Alternativamente, las moléculas de GABA pueden unirse a elementos transsinápticos aún desconocidos para permitir la sinaptogénesis inhibidora. Es de destacar que, de manera similar a las sinapsis GABAérgicas, la activación de los receptores de glicina (GlyR) también puede promover su agrupación sináptica en las neuronas espinales, que podría estar mediada a través de vías comunes de señalización celular posteriores a la activación del receptor53.

Anteriormente, se demostró que las alteraciones de las maquinarias de liberación presináptica tenían efectos menores o nulos sobre la sinaptogénesis, así como sobre la formación de las espinas dendríticas y su mantenimiento54,55,56,57. Vale la pena reconocer que, aunque estos elegantes enfoques genéticos eliminaron la gran mayoría de las actividades sinápticas, sigue siendo plausible que un nivel mínimo de señal transmisora ​​basal, por ejemplo, liberación espontánea residual, sea suficiente para instituir la identidad sináptica. Incluso en ausencia de liberación neuronal, la secreción difusa del transmisor de las células de la astroglia local también puede desencadenar la activación del receptor sináptico58. Alternativamente, las proteínas presinápticas asociadas con la producción enzimática y/o el empaquetamiento vesicular de diferentes neurotransmisores podrían interactuar directa o indirectamente con otras moléculas sinápticas y participar en procesos sinaptogénicos, incluso en ausencia de liberación activa del transmisor. Las contribuciones de la activación del receptor sináptico en la formación de sinapsis glutamatérgicas también siguen siendo controvertidas. Aunque se demostró que la activación persistente de los receptores ionotrópicos de glutamato facilita el crecimiento de la columna59,60,61, la eliminación de todas las subunidades AMPAR y NMDAR no logró afectar la distribución de las vesículas presinápticas ni la morfología postsináptica62. Por lo tanto, múltiples vías paralelas podrían modular el desarrollo de la sinapsis glutamatérgica y estos mecanismos podrían diferir significativamente de la sinaptogénesis GABAérgica. Se necesitan estudios futuros para investigar estas diversas posibilidades.

Utilizando la liberación de glutamato y GABA, estudios anteriores han informado que la liberación aguda de neurotransmisores en sí misma puede facilitar la formación de sinapsis naciente, de una manera espacialmente delimitada26,27. Aquí demostramos que, en el contexto fisiológicamente relevante de la liberación de vesículas presinápticas, dichas sinapsis inducidas por transmisores pueden lograr una maduración morfológica y funcional mucho mayor. En comparación con los métodos de fotoestimulación, las estructuras sinápticas GABAérgicas inducidas por V57 lograron un crecimiento sustancial en su densidad y tamaño, y mostraron IPSC confiables con alta reproducibilidad, lo que las hace susceptibles de una modificación estable, eficiente y extensa de la identidad de la sinapsis. Nuestro protocolo también tuvo éxito tanto en el modelo in vitro de cultivos neuronales humanos como en el cerebro de ratón in vivo y, por lo tanto, podría adoptarse para manipular circuitos afectados por adicción o trastornos mentales.

Utilizando la diferenciación celular mediada por moléculas pequeñas y la detección de factores de transcripción, nosotros y otros hemos obtenido previamente neuronas GABAérgicas directamente de células ES63,64,65,66,67. Estas neuronas diferenciadas o reprogramadas expresan varios marcadores y exhiben propiedades AP que imitan los subtipos de neuronas GABAérgicas autóctonas del cerebro humano. Aunque nuestro enfoque actual no genera linajes neuronales específicos, las sinapsis GABAérgicas producidas por factores V57 manifiestan de manera similar IPSC robustas en miniatura y evocadas con amplitud y frecuencia comparables, que maduran con el tiempo y pueden utilizarse para ensayos in vitro. La transducción viral de enzimas GABAérgicas también ofrece ciertas ventajas sobre las neuronas GABAérgicas inducidas por factores de transcripción, especialmente para sus aplicaciones in vivo. Cuando se trasplantan al cerebro, las neuronas reprogramadas a veces luchan contra la supervivencia a largo plazo, la falta de maduración funcional, la migración restringida y la integración sináptica limitada en circuitos neuronales preexistentes63,64,65. La administración viral de factores V57 puede evitar algunos de estos problemas técnicos formando nuevas sinapsis GABAérgicas en poblaciones neuronales ya disponibles.

Todos los métodos de cultivo celular, así como los procedimientos de producción de lentivirus, fueron aprobados por el Comité Institucional de Bioseguridad (protocolo IRB nº 19-059B) de la Universidad Estatal de Colorado. Todos los experimentos en ratones (incluidos machos y hembras, cepa JAX CBA/CaJ) fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (protocolo IACUC n.° 201800101) de la Universidad de Buffalo y se realizaron de acuerdo con las pautas éticas.

Las células ES humanas (línea H1, n.º de catálogo WA01) se adquirieron en el Instituto de Investigación WiCell en virtud de un acuerdo de transferencia de material (MTA n.º 19-W0439). La línea celular iPS humana (WTC-11) fue donada generosamente por el Dr. Michael E. Ward, del Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares (NINDS). Las células 293T de riñón embrionario humano (HEK) para la producción de virus estaban disponibles comercialmente en Takara Bio USA (n.º de catálogo 632180).

Las construcciones lentivirales utilizadas para la reprogramación neuronal de células ES humanas incluyeron Ngn2-t2A-PuromycinResistance (promotor Tet-on) y rtTA (promotor de ubiquitina), con un virus opcional que codifica EGFP (promotor Tet-on) para análisis morfológicos31. Los ADNc que codifican vGAT, GAD65 y GAD67 humanos (factores V57) se clonaron en un vector lentiviral impulsado por el promotor Synapsin-1 humano (ver Figura complementaria S8b), seguido de un elemento regulador de marmota (WRE) y flanqueado por 5 'y Repeticiones terminales de 3' de largo (LTR).

Se cotransfectaron tres plásmidos auxiliares (es decir, pRSV-REV, pMDLg/pRRE y VSV-G; 7–8 µg cada uno) y los vectores de expresión correspondientes (15–20 µg) con polietilenimina (PEI) en 70–80 % de confluencia. Células HEK 293T (que contienen antígeno T SV40 para facilitar la producción de virus) sembradas en placas de 10 cm. Entre 8 y 10 h después de la transfección, el medio de cultivo se intercambió por completo y el sobrenadante que contenía partículas de lentivirus se recogió después de 36 h y 60 h. Luego se reunió el sobrenadante y se centrifugó a ~800 × g durante 6 a 8 minutos para eliminar cualquier resto de células HEK. Luego, el sobrenadante se hizo girar a ~ 120 000 × g durante 2 h a 4 ° C (ultracentrífuga Beckman L8–70M equipada con rotor SW41Ti). Los sedimentos virales se resuspendieron en aproximadamente 50-100 µl de medio DMEM, se almacenaron durante la noche a 4 °C, posteriormente se dividieron en alícuotas y se congelaron a -80 °C antes del uso experimental.

Tanto las células H1-ES humanas (ver Figs. 1 a 5) como una línea celular iPS isogénica con transgén Ngn2 inducible por doxiciclina (WTC-11; ver Fig. 6) 33 se mantuvieron en medios mTeSR™1 / mTeSR™ Plus ( StemCell Technologies) en condiciones sin alimentador. Los medios se cambiaban todos los días. Cuando la densidad celular alcanzó ~70%, se disociaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS) + EDTA 0,5 mM y se sembraron en placas con una dilución 1:6 en pocillos recubiertos con Matrigel (BD Bioscience). Durante el pase, los cultivos se complementaron adicionalmente con el inhibidor de ROCK Y-27632 (2,5 μM, MedChem Express) durante la noche, pero se excluyeron para cambios de medio posteriores.

Para las células H1-ES, la conversión neuronal directa mediada por Ngn2 se logró como se describió anteriormente31,32. En resumen, las células ES se coinfectaron con lentivirus que codifican rtTA y Ngn2-t2A-PuromycinResistance, se indujeron con doxiciclina (2 μg/ml), se seleccionaron usando puromicina (1 μg/ml), se disociaron suavemente con PBS + EDTA o accutasa (Innovative Cell Technologies) y se volvieron a sembrar con glía primaria de ratón (pase 1–2, derivado de ratones CD-1 ® IGS) en cubreobjetos recubiertos con Matrigel (ver Fig. 1a). Se adoptó una estrategia similar para las neuronas derivadas de células iPS, que fueron reprogramadas directamente por exposición a doxiciclina (ver Figura complementaria S8a)33. Las neuronas se infectaron adicionalmente con lentivirus que expresaban los factores V57 durante o inmediatamente después de la diferenciación, como se muestra en los cronogramas del protocolo, y se usó un virus elaborado a partir del vector pFSW-67 vacío como control de la infección.

Desde el día 0 al 14, las neuronas se cultivaron en medio N3 (DMEM/F12 [Thermo Fisher] + N2 [Thermo Fisher] + B27 [Thermo Fisher]), suplementado con insulina [20 μg/ml, Sigma], penicilina/estreptomicina [ Termo Fisher]). Durante el cocultivo de glía, se incluyó entre 2 y 2,5% de suero bovino fetal (FBS, Atlas Biologicals). Los medios se cambiaron a la mitad cada 3 a 4 días y, además, se complementaron con 5-fluorodesoxiuridina (FdU, 10 µM) para inhibir el crecimiento glial después de alcanzar una confluencia del 70 al 80 %. A partir del día 15, el medio N3 fue reemplazado gradualmente por medio Neurobasal Plus [Thermo Fisher] + B27 + penicilina/estreptomicina, también suplementado con FBS + FdU.

Los registros de neuronas humanas con parches de células enteras se realizaron de forma similar a la descrita anteriormente67,68. En resumen, las neuronas se parchearon utilizando una solución interna que contenía (para fijación de voltaje, en mM) 135 CsCl2, 1 EGTA, 1 NaGTP, 2 QX-314 y 10 HEPES-CsOH (pH 7,4, 310 mOsm); o (para pinza de corriente, en mM) 130 KCl, 10 NaCl, 2 MgCl2, 0,5 EGTA, 0,16 CaCl2, 4 Na2ATP, 0,4 NaGTP, 14 Tris-creatina fosfato y 10 HEPES-KOH (pH 7,3, 310 mOsm). La solución del baño extracelular contenía (en mM) 140 NaCl, 5 KCl, 3 CaCl2, 1 MgCl2, 10 glucosa y 10 HEPES-NaOH (pH 7,4, 300 mOsm). Todas las grabaciones se realizaron a temperatura ambiente, utilizando un amplificador de abrazadera de parche integrado (IPA, Sutter Instruments) controlado por un sistema de adquisición de datos personalizado Igor Pro 8 (WaveMetrics). Para todas las células, la calidad del parche se controló utilizando valores de resistencia en serie (Rs <15 MOhm), que no se alteraron significativamente entre los grupos experimentales. Los registros de pinza de voltaje para AMPAR EPSC y GABAAR IPSC se realizaron a una Vhold de −70 mV, a menos que se indique lo contrario (Fig. 6). Las PSC evocadas se activaron mediante estimulaciones de campo utilizando un electrodo de matriz (FHC, MX21AEW-RT2) conectado a un estimulador de pulso aislado A365RC (World Precision Instruments). Las PSC mediadas por AMPAR o GABAAR se aislaron usando PTX (100 μM; bloqueador GABAAR/GlycineR, Tocris Bioscience) o CNQX (25 μM; bloqueador AMPAR; Tocris Bioscience), respectivamente. Aunque todos los registros de pinza de voltaje en Vhold = −70 mV contenían Mg2+ extracelular para bloquear los NMDAR, algunos experimentos en Vhold = +10 mV (ver Fig. 6) también incluyeron CPP (50 μM; inhibidor de NMDAR; Tocris Bioscience). Se agregó tetrodotoxina (TTX; 2 μM; Ascent Scientific) a la solución externa durante todas las grabaciones de mEPSC y mIPSC en miniatura, para evitar la liberación presináptica causada por AP espontáneas. La perfusión a presión de AMPA 1 mM (bromhidrato de RS-AMPA, Tocris Bioscience) o GABA 1 mM (Tocris Bioscience) se realizó durante 100 ms, con inhalaciones de 20 psi usando Picospritzer III (Parker Instrumentation), y las transferencias de carga totales se calcularon dentro de 30 s de la aplicación de soplo.

Para las figuras 5b-f, las células se incubaron con el antagonista de GABAAR PTX (100 μM) o el antagonista de GABABR CGP55845 (10 μM, Tocris Bioscience) o DMSO (control) inmediatamente después de la co-placa con glía, el día posterior a la inducción. 4–5. Los medios se intercambiaron la mitad cada dos días con dosis equivalentes de fármacos y las células se analizaron entre los días 56 y 60 (Fig. 5a). Para la inmunotinción, los cultivos se lavaron 3 a 4 veces con PBS, se fijaron con paraformaldehído (PFA) al 4% a temperatura ambiente y se procesaron para la incubación de anticuerpos (ver más abajo). Para el parche de células completas, las neuronas se lavaron minuciosamente 3 × 2 minutos con solución de baño antes de registrarlas.

El método de inyección lentiviral in vivo en la ventana redonda del ratón se adoptó de protocolos anteriores utilizando modificaciones menores69,70. En resumen, se hicieron pequeñas incisiones ~ 1 cm caudal al pabellón auricular de ratones neonatales (P2-P4), y se expuso la bulla timpánica para revelar la ventana redonda que se encuentra debajo (consulte la figura complementaria S9a). Se punzó la bulla timpánica con una aguja de calibre 34 y se dejó drenar durante al menos 10 minutos. Se inyectaron lentamente aproximadamente 0,3 µl de lentivirus (un cóctel de 0,1 µl de GAD65, 0,1 µl de GAD67 y 0,1 µl de vGAT) o AAV-chrimson/RFP (control) en la ventana redonda utilizando una jeringa Hamilton de 5 µl con un calibre 34 extraíble. Aguja, bisel de 0,375” y 12°. Tenga en cuenta que un volumen de inyección mayor podría provocar un derrame de líquido, alteración del acueducto coclear y fuga al líquido cefalorraquídeo. Después de retraer la aguja, se suturó el área quirúrgica y los cachorros fueron devueltos a sus jaulas. Los animales adultos se sacrificaron después de 2 a 4 semanas de infección viral y se prepararon cortes de cerebro para experimentos de electrofisiología o de imágenes. Las sinapsis del bulbo terminal se desarrollan rápidamente después del nacimiento y alcanzan la maduración morfológica y funcional aproximadamente a las 3 semanas71,72,73,74.

Los ratones se anestesiaron con 200 mg/kg de ketamina más 10 mg/kg de xilazina, luego se sacrificaron, se extrajeron los cerebros y se colocaron en una solución de sacarosa helada (en mM: 76 NaCl, 75 sacarosa, 25 NaHCO3, 25 glucosa, 2,5 KCl). , 1,25 NaH2PO4, 7 MgCl2, 0,5 CaCl2). Se cortaron secciones sagitales (142 μm) usando un vibratomo (Leica VT1200) y luego se incubaron en una solución de registro estándar (en mM: 125 NaCl, 26 NaHCO3, 20 glucosa, 2,5 KCl, 1,25 NaH2PO4, 1,5 MgCl2, 1,5 CaCl2, 4 Na). L-lactato, 2 Na-piruvato, 0,4 Na L-ascorbato, burbujeados con 95% O2 - 5% CO2) a 34 °C durante 20 min. Posteriormente, las rodajas se mantuvieron a temperatura ambiente hasta el momento de realizar los registros. Durante el registro, se añadió estricnina 1 µM para inhibir las IPSC glicinérgicas espontáneas, se agregaron NBQX 10 µM y CPP 5 µM para bloquear respectivamente las EPSC mediadas por AMPAR y NMDAR, y se agregó bicuculina 20 µM para bloquear las IPSC GABAérgicas. Se realizaron registros de pinza de voltaje de celda completa a partir de BC en cortes AVCN utilizando pipetas con parche de borosilicato con una resistencia de 1,3 a 2,3 MΩ. Las pipetas se llenaron con una solución interna que contenía (en mM): 35 CsF, 100 CsCl, 10 EGTA, 10 HEPES y 1 QX-314, pH 7,3, 300 mOsm. Los BC se parchearon bajo un microscopio Olympus BX51WI con un Multiclamp 700B (Molecular Devices) controlado por una interfaz ITC-18 (Instrutech), impulsado por un software personalizado (mafPC) que se ejecuta en Igor (WaveMetrics). El baño se perfundió a 3–4 ml/min utilizando una bomba (403U/VM2; Watson-Marlow), con solución salina pasando por un calentador en línea para mantener la temperatura a 34 °C (SH-27B con controlador TC-324B; Warner Instrumentos). Los BC se mantuvieron a -70 mV con una resistencia de acceso de 5 a 15 MΩ compensada al 70%. Los terminales presinápticos individuales del bulbo final se estimularon utilizando un microelectrodo de vidrio colocado de 30 a 50 µm de distancia del soma BC con corrientes de 4 a 20 µA a través de un aislador de estímulo (WPI, A360). La estimulación presináptica se aplicó cada 8 s. Para la condición V57, todos los resultados de sEPSC y sIPSC se analizaron a partir de neuronas únicamente con IPSC evocadas detectables.

Los cultivos neuronales humanos con o sin factores V57 se fijaron en PFA al 4% durante 30 minutos a temperatura ambiente. Luego, las células se bloquearon en suero de ternera cósmico (CCS) al 5-10% durante 1 h a 37 °C, se incubaron con anticuerpos primarios (ver Fig. S3 complementaria) durante 1-2 h a 37 °C mientras se balanceaban, se lavaron 4 veces con tampón de bloqueo, seguido de 1 h de incubación a 37 °C con anticuerpos secundarios conjugados con Alexa Fluor (Invitrogen) 488/555/647 [488 anti-ratón de cabra (A11029), 546 anti-ratón de cabra (A11030), 647 anti-ratón de cabra (A11030), ratón (A32728), 488 anticonejo cabra (A11034), 546 anticonejo cabra (A11035), 647 anticonejo burro (A31573), 488 antipollo cabra (A11039), 546 antipollo cabra (A11040), 647 cabra antipollo (A21449), 488 cabra anticobaya (A11073), 555 cabra anticobaya (A21435) o 647 cabra anticobaya (A21450)] en diluciones 1:1000–2000. Luego, los cultivos se lavaron 4 veces con tampón de bloqueo y PBS, y los cubreobjetos se montaron boca abajo sobre portaobjetos de vidrio usando Fluoromount-G (Southern Biotech). Los núcleos celulares se tiñeron con DAPI (1:50000; Thermo Fisher, número de catálogo D1306) durante 5 a 10 minutos, cuando correspondía. La mayoría de los ensayos de inmunotinción se realizaron en un ambiente permeabilizado donde se aplicó Triton X-100 (0,1%) al tampón de bloqueo y para todos los pasos posteriores, incluidos lavados o diluciones de anticuerpos. Sin embargo, para visualizar la localización de los GABAAR en la superficie celular (ver Fig. 5f y Fig. Suplementaria S6d) y sus distribuciones en las ramas dendríticas, utilizamos un anticuerpo primario contra el epítopo extracelular de la subunidad α3 de GABAAR en condiciones no permeabilizadas (sin Triton X-100), posteriormente permeabilizados usando Triton X-100 e inmunomarcados para MAP2 dendrítico.

Para las inmunotinciones del núcleo coclear, a los ratones se les perfundió transcardialmente solución salina al 0,9% seguida de PFA al 4%, luego los cerebros se fijaron posteriormente en PFA al 4% durante una hora y se colocaron en sacarosa al 20% durante la noche. La tinción de la cóclea implicó pasos adicionales, es decir, retirarla del hueso temporal, descalcificación mediante incubación con EDTA 120 mM durante aproximadamente 5 días, seguido de inclusión en gelatina de 100 flores y fijación durante la noche en PFA. Los tejidos embebidos congelados se cortaron en secciones de 50 µm usando un micrótomo, se lavaron 3 veces en PBS 0,2 M (NaCl al 0,9%), se bloquearon con suero de cabra al 5% en PBS + Triton X-100 durante 1 h a temperatura ambiente y se incubaron durante la noche a 4 ° C con anticuerpos primarios (Figura complementaria S3). Las rebanadas se lavaron 3 veces en PBS y se incubaron en una solución que contenía Alexa Fluor (Invitrogen) 568 anti-cabra de burro (A11057), 594 anti-conejo de cabra (A11037), 488 anti-ratón de cabra (A11029) y/o 488 anti-ratón de cabra (A11029). anticuerpos secundarios anti-conejo (A21206) (1:250). Luego, las rodajas se lavaron 3 veces con PBS y se montaron en un medio de montaje antidecoloración de diamante ProLong (Invitrogen, P36961).

Se adquirieron imágenes confocales de neuronas humanas cultivadas utilizando un microscopio de escaneo láser invertido STELLARIS 5 (Leica Microsystems) y se procesaron con un software Leica Application Suite versión X (LAS-X, Core_3.7.4_23463). Se obtuvieron series de proyecciones ópticas z con un espesor óptico de ~0,5–1 µm utilizando un objetivo seco de 20 × u objetivos de inmersión en aceite (40 × o 60 ×). Todas las imágenes de superresolución (véanse las figuras 3f, j, 6d y las figuras complementarias S5a, b) se recopilaron (dimensión en el eje x/y/z: 0,04 × 0,04 × 0,18 μm) utilizando un microscopio Zeiss LSM 880 (Zen 2.3 edición negra, software v.14.0.9.201) equipado con un objetivo de inmersión en aceite plan-apocromático 63× (1,4 na) y un detector de fosfuro de arseniuro de galio (GaAsP) Airyscan, que informó tener una resolución espacial de 120 nm en x/y- y 350 nm en el plano z75. Se capturaron imágenes de tejidos cerebrales de ratón, es decir, núcleo coclear y neuronas del ganglio espiral (ver Fig. 7b y Fig. Suplementaria S9b), utilizando un microscopio confocal Olympus FV1000, con secciones z ópticas de ~ 1,84 µm.

Todas las imágenes confocales se analizaron utilizando el software FIJI-ImageJ (NIH). Para cuantificar varios parámetros de los puntos sinápticos a lo largo de los procesos neuronales, las imágenes generalmente se superpusieron como proyección z de máxima intensidad (10 a 20 cortes ópticos). Las señales sinápticas de las regiones de interés (ROI) se normalizaron con respecto a las áreas de neuritas correspondientes (marcadas con MAP2 o EGFP). La colocalización entre dos marcadores sinápticos se evaluó estableciendo primero un umbral apropiado para los canales individuales para eliminar las señales de fondo para lotes experimentales individuales y luego midiendo los coeficientes de Mander para cada sección óptica dentro del complemento JACoP. Para imágenes de superresolución, se utilizaron módulos de procesamiento y análisis dentro del software ZEN 2.3 (edición azul) (v.2.3.69.1000) para extraer perfiles de intensidad máxima y medir las intensidades de fluorescencia.

Las neuronas humanas derivadas de células iPS de la condición control versus V57 se lavaron con PBS y se recogieron en 500 µl de reactivo TRIzol. Inmediatamente, se agregaron 250 µl de cloroformo al lisado celular, se agitó vigorosamente, se centrifugó a 12.000 × g durante 15 minutos, se recogió la fase acuosa y se precipitó el ARN agregando 250 µl de isopropanol y centrifugando a 12.000 × g durante 10 minutos. Luego, los sedimentos de ARN se lavaron con etanol al 70%, se secaron al aire y se disolvieron en agua nanopura. Se generó ADNc a partir de 300 a 800 ng de ARN total utilizando Invitrogen SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix (n.º de catálogo 11752–050, Thermo Fisher Scientific) siguiendo el protocolo del fabricante. La PCR cuantitativa (qPCR) se realizó en una máquina CFX-96 (Bio-Rad) utilizando SYBR Green Master Mix (n.º de catálogo RK21203, ABclonal). Todos los conjuntos de cebadores se diseñaron para abarcar entre dos exones adyacentes, y se utilizó GAPDH humano como control interno (consulte la figura complementaria S8c, d).

Los resultados de la secuenciación de ARN de neuronas humanas inducidas por Ngn2 (Figura complementaria S1c) fueron depositados previamente por nosotros en la base de datos de los NIH (repositorio GEO, número de acceso GSE129241 [https://www-ncbi-nlm-nih-gov.ezproxy.u] -pec.fr/geo/query/acc.cgi?acc=GSE129241])32, y están disponibles públicamente.

Las neuronas NV57 de los días 56 a 60 se recogieron mediante raspado y se lisaron en tampón RIPA (NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, Tris 25 mM, pH 7,4, sustituto Nonidet P-40 al 1%, desoxicolato de sodio al 0,5%) suplementado con cóctel inhibidor de proteasa HaltTM. (PIC, Thermo Scientific, catálogo n.° 78429). Los lisados ​​se mezclaron a 3:1 con tampón de carga de dodecilsulfato de sodio (SDS) 4x, se procesaron en gel de poliacrilamida al 7,5 % (PAGE) y luego se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. Las membranas se bloquearon con albúmina sérica bovina (BSA) al 3% en solución salina tamponada con Tris (TBS + Tween-20 al 1%) durante 2 a 3 h a temperatura ambiente y se inmunotiñeron durante la noche a 4 ° C con anticuerpos primarios. Posteriormente, las membranas se tiñeron con anticuerpos secundarios fluorescentes (1:2000 en TBS + Tween-20) durante 2 a 3 h a 37 °C, se tomaron imágenes con el sistema LI-COR Odyssey CLx y se analizaron con el software Image Studio Lite (versión 5.2).

Para todos los resultados experimentales, los valores promedio se presentaron como X/Y, donde 'X' representa el número total de neuronas registradas (para electrofisiología) o campos de visión analizados (para imágenes) del número 'Y' de lotes independientes ( para neuronas humanas) o animales (rebanadas de cerebro de ratón). Todos los datos promedio indican medias ± SEM (desviación estándar [SD] de un parámetro dividido por la raíz cuadrada del número de muestras). Todas las muestras se eligieron al azar y no se excluyó ningún dato del análisis. Se utilizaron al menos> = 3 réplicas biológicas y se seleccionaron tamaños de muestra de modo que SEM ≈ <1/10 de sus medias respectivas para la mayoría de los conjuntos de datos. Excepto las higos. 3 y 5, los investigadores no estaban cegados a la asignación durante los experimentos o las evaluaciones de resultados, porque muchos ensayos requerían conocimiento previo de la identidad del fármaco durante las aplicaciones agudas (Figs. 1, 2, 6 y 7), combinaciones de transgenes (Figs. 1 y 7) , o recolecciones y procesamiento de muestras en intervalos de tiempo específicos (Fig. 4).

Los valores numéricos de todos los paneles de figuras (tanto principales como complementarios) se proporcionan como un archivo de datos de origen. Para conjuntos de datos distribuidos casi normalmente (es decir, con valores de asimetría y curtosis −2 > ≈ y ≈ < 2), se realizaron evaluaciones estadísticas entre condiciones utilizando la prueba t de Student no apareada (emparejada para comparaciones por lotes), de dos colas (** *P < 0,005; **P < 0,01; *P < 0,05; ns = no significativo, P > 0,05); de lo contrario, se realizó la prueba U de Mann-Whitney no paramétrica bilateral como se menciona en las leyendas de las figuras correspondientes. Para todas las evaluaciones grupales, se informaron los valores P del ANOVA de un solo factor (para una distribución de datos casi normal) o la prueba de Kruskal-Wallis (para desviaciones considerables de la distribución normal).

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de la naturaleza vinculado a este artículo.

Los datos fuente se proporcionan con este documento (ver archivo Excel). Estos incluyen todos los puntos de datos individuales y los valores promedio presentados tanto en el manuscrito principal (Figs. 1 a 7) como en la información complementaria (Figs. S1 a S10). Los datos sin procesar para experimentos de imágenes y electrofisiología están disponibles a través de los autores correspondientes, previa solicitud razonable. El conjunto de datos de secuenciación de ARN de neuronas Ngn2 se puede obtener del repositorio GEO disponible públicamente (n.º de acceso GSE129241), tal como lo depositó nuestro estudio anterior32. Los datos originales se proporcionan con este documento.

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Este trabajo fue apoyado por un fondo inicial de la Universidad Estatal de Colorado para SC y subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud (R01-MH126017 para SC; R37-MH052804 para TCS; y R01-DC015508 para MAX). Agradecemos a los Dres. Robert E. Cohen y Tingting Yao, de la Universidad Estatal de Colorado, por proporcionarnos un microscopio Zeiss LSM 880 con detector Airyscan para adquirir imágenes de súper resolución de las sinapsis. También agradecemos al Dr. Michael E. Ward, NINDS, por proporcionarnos la línea celular iPS WTC-11.

Estos autores contribuyeron igualmente: Scott R. Burlingham, Nicole F. Wong, Lindsay Peterkin.

Bioquímica y Biología Molecular, Universidad Estatal de Colorado, Fort Collins, CO, EE. UU.

Scott R. Burlingham, Lindsay Peterkin, Lily Lubow, Carolina Dos Santos Passos, Orion Benner, Thomas P. Cast y Soham Chanda

Ciencias Biológicas, Universidad Estatal de Nueva York en Buffalo, Buffalo, NY, EE. UU.

Nicole F. Wong y Matthew A. Xu-Friedman

Ciencias Biológicas, Universidad Estatal de California Fullerton, Fullerton, CA, EE. UU.

Michael Ghebrial

Fisiología molecular y celular, Facultad de Medicina de la Universidad de Stanford, Stanford, CA, EE. UU.

Thomas C. Südhof y Soham Chanda

Neurociencias moleculares, celulares e integradas, Universidad Estatal de Colorado, Fort Collins, CO, EE. UU.

Soham Chanda

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TCS y SC concibieron el proyecto; SC supervisó la investigación; MAX, TCS y SC diseñaron los experimentos; SRB, NFW, LP, LL, CDSP, OB, MG y SC realizaron los experimentos; SRB, NFW, LP, OB, TPC y SC analizaron los datos; MAX, TCS y SC escribieron el artículo; Todos los autores revisaron el manuscrito.

Correspondencia a Matthew A. Xu-Friedman, Thomas C. Südhof o Soham Chanda.

Los autores no declaran intereses en competencia, ya sean financieros o no financieros, en relación con el trabajo descrito en este estudio. Todas las solicitudes de reactivos experimentales deben dirigirse a SC ([email protected]).

Nature Communications agradece a los demás revisores anónimos su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de revisión por pares están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

Burlingham, SR, Wong, NF, Peterkin, L. et al. Inducción de la formación de sinapsis mediante síntesis de novo de neurotransmisores. Nat Comuna 13, 3060 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-30756-z

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Recibido: 23 de septiembre de 2021

Aceptado: 17 de mayo de 2022

Publicado: 01 de junio de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-30756-z

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